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ESPECTROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA

La fluorescencia es un proceso de emisión en el cual las moléculas son excitadas por la absorción de radiación electromagnética y al relajarse al estado basal liberan el exceso de energía en forma de fotones.

Las dos principales ventajas de los métodos de fluorescencia sobre los de absorción son: 1) Una sensibilidad entre 1 y 3 órdenes de magnitud mayor, y; 2) Mayor intervalo de respuesta lineal. No obstante, los métodos de fluorescencia se aplican menos que los de absorción ya que no todos los sistemas químicos son capaces de fluorescer y además el equipamiento necesario es mucho más costoso que el de la espectroscopia de absorción.

Sustancias fluorescentes:

Fluorescencia y fosforencencia:

Teoría de la fluorescencia

La Figura 5 muestra un diagrama de energía parcial para una especie molecular hipotética. Se presentan un nivel electrónico basal (subEo_sin_parentesis.bmp) y dos excitados (subE1.bmp y subE2.bmp). Cada uno de estos estados electrónicos muestra 4 niveles vibracionales. Cuando la molécula se irradia con ondas electromagnéticas cuya energía coincide con las diferencias de energía entre los diferentes niveles se producen las transiciones electrónicas que se muestran en la Figura 5a. La relajación molecular, señalada por las flechas cortas entre niveles de energía vibracionales tiene lugar durante las colisiones entre moléculas excitadas y las moléculas del disolvente (Figura 5b). También puede ocurrir el relajamiento no radiante entre el nivel vibracional inferior de un estado excitado y el nivel vibracional superior de otro estado electrónico. La fluorescencia es otro proceso de relajación que se muestra en la Figura 5c. La radiación fluorescente se emite cuando las moléculas electrónicamente excitadas se relajan a cualquiera de los estados vibracionales del estado electrónico basal.

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Animación sobre emisión fluorescente:

Nótese que en esta animación el "ojo" debe ser interpretado como un detector de radiación, ya que la radiación emitida por fluorescencia cae en numerosas ocasiones dentro del espectro de radiación ultravioleta, y por lo tanto no siempre es visible al ojo humano.

Especies fluorescentes

La fluorescencia es uno de los mecanismos mediante las cuales una molécula regresa a su estado basal después de haber sido excitada por absorción de radiación. Por lo tanto, a priori cualquier molécula capaz de absorber radiación electromagnética sería capaz de fluorescer. No obstante, la mayoría de las moléculas no fluorescen porque disponen de vías no radiantes.

Fluorescencia y estructura

La mayoría de los compuestos que contienen anillos aromáticos proporcionan emisión fluorescente. Ciertos compuestos carbonílicos alifáticos y alicíclicos y estructuras de dobles enlaces también lo hacen. Sin embargo, su número es pequeño en comparación con el número de compuestos fluorescentes que contienen anillos aromáticos.

La mayoría de los hidrocarburos aromáticos no sustituidos fluorescen con una emisión fluorescente creciente con el número de anillos y con su grado de condensación. Los anillos heterocíclicos más sencillos (piridina, furano, pirrol,...) no fluorescen (Figura 6) pero las estructuras de anillos fusionados con más de dos anillos (quinolina, isoquinolina, indol) lo hacen con frecuencia (Figura 7).

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Efecto de la rigidez estructural

La fluorescencia está favorecida por moléculas rígidas. Así por ejemplo, el rendimiento fluorescente (simbol.bmp) del bifenilo es aproximadamente 0.2 en tanto que la del fluoreno es 1 (Figura 8). La diferencia puede ser el resultado de la rigidez que le otorga al bifenilo el puente formado por el metileno. Esta rigidez reduce las posibilidades de relajación por vías vibracionales y permite que se produzca la emisión fluorescente.

Equipos de medida de fluorescencia

Un fluorímetro (Figura 9) consta de una fuente de luz y de un sistema de selección de longitud de onda de excitación. Cuando la muestra es excitada con radiación de energía apropiada emite radiación en todas las direcciones del espacio. No obstante la luz emitida se detecta mejor en ángulo recto con respecto al haz de excitación ya que se evitan problemas de dispersión de la luz y también el haz de luz excitante que es de mucha mayor intensidad que el haz de luz emitida. La luz emitida es recogida seleccionando una longitud de onda apropiada y conducida a un detector donde queda registrada por sistemas similares a los de un espectrofotómetro de absorción.

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